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再生圈新贵—外泌体的研究热点及同腾新创CEL-G®平台应用
发布日期：2025-01-13
近年来，双诺奖加持使得外泌体（Exosome）研究热度一直有增无减，有关外泌体报导文章陆续发表在各大顶级期刊上。根据最新版的细胞外囊泡研究指南（MISEV2023）的定义，外泌体是指通过多泡体（multivesicular body, MVB）释放的来自细胞内部核内体系统的外囊泡 (EV)，直径大约为30-150nm，磷脂双分子层表面具有多种特异性膜蛋白，经典标志物有CD9、CD81和CD63等，内部包含着多种核酸、蛋白质、RNA、DNA和脂质等，广泛分布于血液、尿液、脑脊液、唾液、乳汁、胆汁等各种体液中。外泌体的主要作用是信息传递，外泌体发挥功能作用可通过受体-配体作用内化、胞吞或与靶细胞的膜融合等方式将内容物传递至受体细胞内，从而引起相应的功能改变（Figure 1）[1]。
Figure 1 外泌体形成和生物学作用[1]
外泌体研究前沿呈现出
多领域快速推进的态势
外泌体在再生和皮肤美容科领域受到越来越多的关注。外泌体在伤口愈合、疤痕预防、光损伤预防、皮肤再生、提高移植成功率、减轻脱发、抗衰老等方面得到广泛应用。美国Brexogen Inc.的外泌体疗法是首个进入临床试验的特应性皮炎外泌体治疗药物。
外泌体在临床医学领域有着巨大应用前景，主要包括疾病诊断、疾病治疗和药物递送。
诊断医疗：外泌体诊断技术发展迅速，为疾病诊断、治疗和监测健康状况提供了新的方法（Figure 2）。目前已经启动至少204项与外泌体相关的临床试验，其中分别有114项和74项与治疗和诊断相关的试验， Bio-Techne公司针对前列腺癌的ExoDx Prostate Intelli Score Test和Guardant Health公司的Guardant 360CDx液体活检测试作为辅助诊断(CDx)均已获得美国FDA批准。
Figure 2 外泌体的多种医学应用[2]箭头代表外泌体在不同医学领域的各种来源和应用。
疾病治疗：外泌体在各种疾病治疗中均具有巨大的潜力，包括癌症、心血管疾病、神经系统疾病和自身免疫性疾病。基于外泌体的疗法的有效性和安全性，外泌体在疾病治疗方面显示出广阔前景（Figure 3）。
Figure 3 外泌体主要布局疾病领域
药物递送：由于外泌体在人体内就承担细胞间物质运送的功能，因此利用其优异的生物特性用于装载药物，是一种极具潜力的内源性非病毒的药物递送系统。当前最火热的细胞基因治疗领域，其核心就是将治疗性基因片段（DNA、RNA等）递送至特定细胞，从而实现较传统药物更精准的治疗效果。
工程化改造技术：通过基因编辑等技术对外泌体进行工程化改造，使其具有更优的靶向性、载药能力和稳定性。
分离与纯化技术：新的外泌体分离和纯化技术不断涌现，如切向流技术可从干细胞培养上清中高效提取和浓缩外泌体，提高了生产效率和纯度。
2024年10月31日，国家药品监督管理局医疗器械标准管理中心发布的2024年第二次医疗器械产品分类界定结果汇总，明确干细胞外泌体 “建议不作为医疗器械管理的产品”。这主要是因为干细胞外泌体本身有比较高的活性，可能通过渗透吸收进入体内发挥药理作用，因此不符合医疗器械类产品只能有物理作用而没有药理作用的要求。这意味着未来干细胞外泌体这一大类产品不能通过医疗器械产品通道进行申报，但是其他类别的外泌体并不在此列。而含干细胞外泌体的产品原则上可以通过药械联合的方式进行申报。
全球方面，外泌体的监管标准因地区而异，并取决于其特性。在美国和欧洲，基于外泌体含量是否影响生理功能；在日本、韩国和台湾，则基于外泌体的获取方式。
Table 1外泌体全球政策[3]
根据BCC Research的报告，全球外泌体诊断、治疗和研工具市场在2023年达到了2.275亿美元，并预计到2028年将增长至13亿美元，表现出了42.2%的复合年增长率（CAGR）。这一增长得益于生物医学研究投资的增加、精准医疗趋势的推动以及外泌体研究工具的技术进步[4]。
为了推动和加快外泌体行业的发展，同腾新创全面为外泌体生产企业提供高质量的本土化细胞研发和生产解决方案，开发了CEL-G®上下游一站式外泌体制备平台，可实现从培养到收获的全封闭式无缝连接。上游采用CEL-G® Culture Ad60系列固定床生物反应器（Ad60 FBR）搭配使用2款间充质干细胞（MSCs）无血清培养基，进行细胞扩增和大规模外泌体的生产，下游采用CEL-G® TFF Lab外泌体浓缩系统（TFF Lab）进行高效的过滤和外泌体纯化（Figure 4）。
Figure 4 同腾新创CEL-G®外泌体一站式制备平台
上游工艺：干细胞3D培养和大规模外泌体生产
CEL-G® Culture MSC Basal SFM间充质干细胞无血清培养基适用于脐带、骨髓、脂肪等多种来源的间充质干细胞的原代分离培养，传代扩增培养。以MSCs为例，可以支持MSCs稳定传代至15代，MSCs传代P5、P10、P15时，均能维持表面标记物的表达，阳性标记物≥95.00%，阴性标记物≤2.00%（Figure 5），符合国际细胞治疗协会和中检院检定标准。
Figure 5 MSC Basal SFM培养基稳定维持MSC表面标记物的表达
CEL-G® Culture MSC ExoPro SFM间充质干细胞无血清培养基适用于脐带、骨髓、脂肪等多种来源的间充质干细胞的外泌体生产的细胞扩增阶段、收获阶段，支持MSCs 2D 3D 胞培养，且外泌体产量高。
传统贴壁细胞2D培养（特别是干细胞培养）过程中存在大量人工操作，系统不够密闭，规模化放大困难等痛点。同腾新创自主研发的Ad60 FBR是国内首创规整性固定床生物反应器，是一款全封闭GMP自动化系统，适用于大规模细胞培养及外泌体收获，独特的瀑布流技术为细胞生长提供低剪切力的3D培养环境，从而实现外泌体低成本、高效率生产。另外，通过Ad60 FBR搭配使用MSC ExoPro SFM培养MSCs，可进行多次上清收获，外泌体产量远远高于其他培养基和微载体（Figure 6）。
Figure 6 Ad60 FBR搭配不同培养基的外泌体产量对比
传统的外泌体分离方法主要包括超速离心法、聚合物沉淀法、免疫亲合法、凝胶排阻色谱法、亲和磁珠法、超滤膜法、密度梯度离心法等，存在通量小、耗时长、外泌体完整性差、不适合规模化处理等不足之处。TFF Lab可高效开展外泌体大规模分离和纯化，该系统基于三级分离原理，采用切向流技术对外泌体进行浓缩和富集。系统配备控制器主机、人机交互界面和一次性封装耗材包，自动运行“浓缩/缓冲液置换-收获-清洗”等多级程序，实时监测、定量收获、耗时短、效率高、高倍浓缩外泌体，整个处理过程静音、安全、顺畅，收获的外泌体符合相关鉴定标准，保持了外泌体的完整性和生物学活性。
使用TFF Lab分离纯化Ad60 FBR生产的MSCs来源的细胞上清液可提取出高质量的外泌体。外泌体终产物纯度明显提高，浓缩前MSCs上清外泌体纯度4.62×107 Particles/μg，经过缓冲液置换和除菌收获后MSCs外泌体纯度达到30.29×107 Particles/μg（Figure 7A），杂蛋白去除率达到了93%。浓缩前MSCs上清NTA颗粒浓度12×1010 Particles/mL，缓冲液置换和除菌收获后MSCs外泌体 NTA颗粒浓度达到110×1010 Particles/mL，结果表明外泌体终产物比上清浓度显著提高（Figure 7B）。
Figure 7 TFF Lab的处理效果 A.浓缩前后纯度对比，B.浓缩前后NTA颗粒浓度对比
通过TFF Lab处理后得到的MSCs外泌体符合外泌体鉴定标准，透射电镜下呈杯状、圆形或类圆形的膜性小囊泡，可见囊泡的双膜性结构，中央为低电子密度成分分布较集中且边界清晰（Figure 8）。
Figure 8 透射电镜下外泌体形态
同腾新创自成立以来，不断探索与突破，上市了两款MSC无血清培养基，不仅实现了出色的细胞扩增，而且大幅度提高了外泌体的产量。Ad60 FBR和TFF Lab作为公司精心打造的两款高性能设备也已经在市场上赢得了用户广泛的认可与好评，自动化设备让上游大规模外泌体生产和下游大规模外泌体浓缩变得更省时、更高产，更高效！
[1] Marote A, Teixeira FG, Mendes-Pinheiro B, et al. MSCs-derived exosomes: cell-secreted nanovesicles with regenerative potential[J]. Front Pharmacol, 2016, 7: 231
[2] Qiao X, Tang J, Dou L, Yang S, Sun Y, Mao H, Yang D. Dental Pulp Stem Cell-Derived Exosomes Regulate Anti-Inflammatory and Osteogenesis in Periodontal Ligament Stem Cells and Promote the Repair of Experimental Periodontitis in Rats. Int J Nanomedicine. 2023 Aug 17;18:4683-4703. doi: 10.2147/IJN.S420967. PMID: 37608819; PMCID: PMC10441659
[3] HE Hongzhi , MA Dandan. Research progress on exosomes derived from dental pulp stem cells[J]. Journal of Prevention and Treatment for Stomatological Diseases, 2019, 27(10): 652-657 https://doi.org/10.12016/j.issn.2096-1456.2019.09.008
[4] Mai Z, Chen H, Ye Y, Hu Z, Sun W, Cui L, Zhao X. Translational and Clinical Applications of Dental Stem Cell-Derived Exosomes. Front Genet. 2021 Oct 26;12:750990. doi: 10.3389/fgene.2021.750990. PMID: 34764982; PMCID: PMC8576041.
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