在CEL-G® Culture Ad60固定床生物反应器中进行细胞裂解条件研究

同腾新创开发的CEL-G^®Culture Ad60系列固定床生物反应器（Ad60 FBR），具有独特的瀑布流设计，让固定床具备更小的剪切力，提供更加亲和的细胞培养环境。能够提供从1㎡到100㎡培养面积，是培养贴壁细胞进行基因和病毒载体收获的理想平台。

图1. CEL-G^®Culture Ad60系列固定床生物反应器

根据病毒形态结构的的不同，可以简单把病毒分为胞内病毒和胞外病毒，对于胞内病毒（如AAV，ADV），需要对细胞进行裂解，破碎细胞后使胞内病毒释放，然后进行收取。因此，在固定床反应器中培养贴壁细胞生产胞内病毒时，就需要在收获病毒时在反应罐内进行一步原位裂解细胞操作。

当前主流的裂解细胞的方式有2种，即热休克（反复冻融）法和裂解液裂解法。热休克法在使用培养瓶和细胞工厂生产病毒中较为常用，在反应器生产病毒中普遍使用裂解液裂解细胞。常用的细胞裂解液原理大多相似，但裂解过程中裂解液的组分、pH、裂解过程都会对最终病毒收获效率产生影响，裂解液的pH直接影响细胞的裂解效率，碱性环境更利于细胞裂解。同时，病毒载体的活性同样直接受到溶液环境中的pH影响。已知的可以维持病毒载体活性的pH范围在5.0-9.0左右，过高或过低均可能导致病毒载体的活性降低。在本实验中，我们在Ad60 FBR 2㎡固定床中培养293T细胞，在培养结束后尝试了pH7.0/8.0/9.0的裂解液来裂解细胞，寻找最适合病毒载体收获的细胞裂解条件。

裂解结束后，实验过程中不同步骤收获的3瓶液体区分明显，裂解后最终收获的裂解液颜色呈乳白色，结晶紫染细胞核计数，结果显示其中含有大量细胞和细胞碎片；对罐内取出的裂解前后取样条进行结晶紫染色对比，发现残留在膜上被染色的细胞极少；剪碎取样条计数，对比裂解前后膜上细胞量，数据显示最终裂解效率可达90%以上，证实在裂解液pH9.0时可以基本完全裂解细胞，达到释放胞内病毒的目的。

图2. pH9.0裂解前后上清对比

图3. pH9.0结晶紫染色裂解前后取样条

但同时，当裂解液的pH为7.0和8.0时，反应器中细胞裂解率则显著降低，仅有44.3%和68.3%，且和pH有线性相关：在pH7.0-9.0之间时，随着pH升高，裂解效率逐步升高。

表1. 不同pH实验组裂解前后总细胞数和细胞裂解率

图4. 不同pH时贴壁细胞的裂解效率

通过3次在Ad60 FBR中使用不同pH裂解液裂解测试实验，得出结论，使用pH9.0的裂解液配方（50mM Tris +2mMMgCl₂+1%tween20+25U/ml核酸酶 pH9.0）可以满足固定床培养细胞后收获病毒的需要，在pH降低到8.0和7.0时，裂解率随pH降低而降低。

综上，通过此次细胞裂解条件的研究，我们看到Ad60 FBR不仅可用于胞外病毒载体生产，在胞内病毒收获工艺中也有很大的应用潜力，并可方便的开展小试工艺研究，从而加速细胞及基因治疗药物从研发到临床的开发进程。