在Ad60 FBR中使用低渗裂解法原位裂解细胞

图1.CEL-G^® Culture Ad60系列固定床生物反应器

根据病毒类型的不同，病毒载体的收获可分为直接从培养上清中收集出芽病毒载体和通过裂解细胞，收集裂解后的抽提液来收获释放的病毒载体两种途径。

使用化学法搭配酶解法进行细胞裂解时，溶液的pH会直接影响裂解效率以及收获的病毒生物滴度。而且新加入的试剂同时会对下游纯化造成一定的影响，增加下游工艺的复杂性。使用低渗裂解法，通过渗透压差异裂解细胞，在成本、效率和回收率上都是一种值得尝试的新型方案。

在本实验中，我们尝试了低渗裂解法来裂解细胞，探究低渗裂解法在固定床生物反应器中对贴壁细胞的裂解效果。

(1) 配制低渗裂解液，本实验使用1/10稀释的PBS作为低渗裂解液，向900ml注射用水中加入100ml DPBS，混匀后高温灭菌，冷却至室温备用。

(2) 在2平米固定床上接种293T细胞，培养至day5，细胞密度生长至3.96×10⁵/cm²时终止培养。泵出反应器内培养基，用1L PBS冲洗固定床10min，泵出PBS冲洗液，加入等体积低渗裂解液。

(3) 将固定床温度设置为37.0±0.5℃，pH分别控制在7.0±0.2，转速设置为620rpm裂解1h。

(4) 裂解结束后，泵出裂解液。从固定床中取出取样条裂解，结晶紫染色进行细胞核计数，根据裂解前后取样条细胞量计算细胞裂解效率。

(1) 裂解前后，取样条上的细胞出现显著性降低，裂解前细胞分布在培养膜上，培养膜呈不透明形态。裂解后，细胞破碎，培养膜空隙显露出来（图2）。

(2) 裂解前后，裂解液浊度存在明显区别。裂解液颜色由澄清透明变成乳白色，显微观察发现其中含有大量细胞和细胞碎片（图3）。

(3) 在裂解前后，分别从固定床中取出取样条进行细胞核计数，裂解前细胞密度为3.96×10⁵/cm²，裂解1h后，细胞密度降低至3.46×10⁴/cm²，绝大部分细胞均被裂解，裂解效率高达91.3%（图4）。

(4) 裂解期间，裂解液渗透压持续上升，直至维持相对稳定，说明使用低渗透压裂解细胞可以在1h完成绝大部分细胞的裂解（图5）。

图2. 裂解前后取样条对比

图3. 裂解前后上清液对比

图4.裂解前后细胞密度

图5.裂解过程中渗透压变化曲线

使用Ad60 FBR进行细胞培养，当涉及到破碎细胞回收产物时，采用低渗裂解法进行细胞裂解是一种低成本、高效率且能够保证产物活性的方式。低渗裂解液不会带入新的成分，且不影响产物的效价，1h便能够实现90%以上的细胞裂解。使用Ad60 FBR配合低渗裂解法，可以非常高效的完成细胞培养和产物回收，是进行如病毒培养、疫苗生产的不二选择。